Genetyka

Kariotyp, kariogram, ideogram, Wskazania do badań kariotypu

Kariotyp to zestaw chromosomów charakterystyczny dla
danego gatunku (organizmu).
Każda para chromosomów homologicznych zawiera jeden
chromosom odziedziczony od matki i jeden od ojca.

Wskazania do badania kariotypu:

niepłodność
chore potomstwo
nieprawidłowe cechy płciowe
upośledzenie umysłowe
wady rozwojowe
martwy płód z widocznymi wadami

Kariogram to kariotyp przedstawiony w postaci graficznej,

kolejne pary chromosomów homologicznych są ułożone
według kolejności, zgodnie z ich długością i położeniem
centromeru; na końcu umieszczone są chromosomy płciowe.

Schematycznym przedstawieniem graficznym kariogramu
jest ideogram.

2. Etapy analizy cytogenetycznej

Etapy analizy cytogenetycznej:

pobranie materiału,
hodowla komórkowa,
traktowanie i utrwalanie hodowli komórkowej,
sporządzenie preparatów oraz „dojrzewanie” preparatów,
wybarwienie chromosomów,
analiza mikroskopowa oraz diagnoza.

OPIS:

1.Pobranie materiału

Techniki hodowli chromosomów mitotycznych in vitro z:

limfocytów krwi obwodowej,
fibroblastów,
leukocytów,
komórek szpiku kostnego,
komórek embrionów,
komórek miazgi pióra.

Techniki izolacji chromosomów mejotycznych:

męskich (z jąder)
żeńskich (z jajników)

Prawidłowe pobranie materiału do badań:

aseptycznie,
musi zawierać żywe komórki,
na odpowiedni antykoagulant lub pożywkę komórkową,
nie wolno zamrażać,
materiał musi zostać opisany (gatunek, data, rodzaj
badania itp.)

2. Hodowla komórkowa

Aby obserwować chromosomy, niezbędne jest uzyskanie dzielących się
komórek w trakcie hodowli. Hodowla komórek in vitro jest procesem
namnażania komórek w sztucznych warunkach poza organizmem.
Brak wzrostu hodowli uniemożliwia wykonanie badania ze względu na to,
że chromosomy można analizować tylko w komórkach w trakcie
prometafazy lub metafazy podczas podziału komórki.

Zakładanie hodowli in vitro odbywa się w specjalnych aseptycznych
warunkach przy użyciu komór z przepływem laminarnym, które dzięki
posiadanym filtrom powietrza zapewniają aseptyczne warunki wewnątrz komory.

W zależności od typu komórek rozróżnia się dwa rodzaje hodowli:

hodowle w zawiesinie, gdzie hodowane komórki swobodnie „pływają” w
pożywce, oraz hodowle adhezyjne, gdzie hodowlane komórki przylegają
do dna naczynia hodowlanego.

W zależności od rodzaju materiału hodowlę komórkową zakłada się w
specjalnych jednorazowych naczyniach hodowlanych. Mogą to być
m.in. butelki tzw. typu Falcon, szalki Petriego, butelko hodowlane.
Do każdego rodzaju materiału dobiera się odpowiedni typ pożywki
komórkowej oraz substancje stymulujące po to, aby w sztucznych
warunkach wywołać podziały komórkowe.

Aby zmniejszyć ryzyko infekcji hodowli komórkowej, do podłoża
komórkowego dodaje się antybiotyki i substancje przeciwgrzybicze.
Czas trwania hodowli in vitro jest zależny od rodzaju materiału do
badań.

Hodowla limfocytów trwa średnio 72 godziny (48-92 godziny).
Hodowla komórek płynu owodniowego trwa średnio 7-10 dni (5-15 dni).
Hodowla kosmówki krótkoterminowa (STC – short term culture) trwa
około 24 godzin, długoterminowa (LTC – long term culture) około 72
godzin. Hodowla fibroblastów skóry właściwej trwa około 1 miesiąca.

3.Traktowanie i utrwalanie hodowli komórkowej

Synchronizacja hodowli komórkowej polega na wstrzymaniu komórek
w hodowli na etapie fazy S cyklu komórkowego, a następnie na
uwolnieniu czynnika hamującego, dzięki czemu wszystkie nagromadzone
komórki równocześnie wchodzą w fazę G2 i mitozę. Powoduje to tzw.
synchronizację cyklu komórkowego w komórkach hodowli, co następnie
ułatwia wybór momentu utrwalania, kiedy wiele komórek jest w stadium prometafazy.

Hodowlę komórkową można synchronizować tak, aby uzyskać
chromosomy o wyższej jakości (długości i rozdzielczości) lub wyższy
indeks mitotyczny (czyli większą ilość metafaz w stosunku do ilości komórek).

Hodowle komórkowe traktuje się również czynnikami niszczącymi
wrzeciono kariokinetyczne, które bierze udział w rozchodzeniu się
chromosomów do komórek potomnych. Zahamowanie tego procesu
powoduje zatrzymanie podziału komórkowego na etapie metafazy, a tym
samym uniemożliwia przejście komórek do kolejnej fazy cyklu
komórkowego. Tego typu traktowanie umożliwia nagromadzenie komórek w metafazie.

Przed procesem utrwalania hodowlę komórkową poddaje się również
działaniu roztworu hipotonicznego. Podczas tego traktowania woda
wnika do komórek, które pęcznieją, a cytoplazma staje się rzadsza,
dzięki czemu wykonanie preparatu jest łatwiejsze. Preparat zawierający zbyt dużo gęstej cytoplazmy oraz chromosomy skupione w
centrum komórki nie nadaje się do analizy, gdyż leżące zbyt blisko
siebie chromosomy trudno policzyć, a pokrywająca je warstwa gęstej cytoplazmy uniemożliwia odpowiednie ich wybarwienie.

Proces utrwalania rozpoczyna się bezpośrednio po traktowaniu hodowli
roztworem hipotonicznym. Do utrwalania komórek do celów
cytogenetycznych zawsze używa się mieszaniny stężonego kwasu
octowego i metanolu. Utrwaleniu ulegają DNA chromosomów, a w
mniejszym stopniu białka cytoplazmy.

Cały proces traktowania i utrwalania przeprowadza się według
odpowiedniej dla każdej tkanki procedury w taki sposób, aby uzyskać
jak największą liczbę metafaz, jak najdłuższe chromosomy oraz
minimalną ilość cytoplazmy. Po utrwaleniu hodowli komórkowej
uzyskuje się zawiesinę komórek w utrwalaczu lub od razu preparat z
komórkami, jeżeli komórki były hodowane bezpośrednio na specjalnych
szkiełkach mikroskopowych (hodowle adhezyjne).

4.Sporządzenie oraz „dojrzewanie” preparatów
Preparat cytogenetyczny jest to mikroskopowe szkiełko podstawowe,
na którym znajdują się utrwalone komórki z hodowli komórkowej.

Preparaty takie przygotowuje się na dwa sposoby:

przez nakropienie zawiesiny utrwalonych komórek oraz wysuszenie ich w odpowiedniej temperaturze i wilgotności,

przez usunięcie utrwalacza z hodowli adhezyjnej;
Suszenie musi się odbywać w odpowiedniej dla danej tkanki
temperaturze i wilgotności – zapewnia to właściwy czas suszenia
preparatu. Zbyt szybkie lub zbyt powolne suszenie może powodować
powstanie preparatu nienadającego się do analizy. Komórki podczas
suszenia na szkiełku rozciągają się oraz pękają, powodując odpowiednie rozłożenie chromosomów.

Gotowe, wysuszone w odpowiedni sposób preparaty muszą „dojrzeć”.
„Dojrzewanie” preparatów to ponowne ich suszenie w podwyższonej
temperaturze. Może trwać od kilku godzin do kilku dni. „Dojrzewanie”
powoduje właściwe wysuszenie preparatu, aby można było uzyskać
wzory prążkowe o odpowiedniej jakości.

5.Wybarwienie chromosomów

TECHNIKI BARWIENIA CHROMOSOMÓW

Rutynowe – umożliwiające obserwacje
chromosomów w mikroskopie świetlnym
Ujawniające specyficzne rejony chromosomu

barwienie CBG
barwienie Ag-NOR

Replikacyjne – umożliwiające identyfikację
chromosomów homologicznych

RBG RBA
GTG
T
QFQ

Techniki prążkowania chromosomów oznaczane są
trójliterowym kodem.

Pierwsza litera oznacza typ prążkowania: R, G, Q, C, T,

Druga określa technikę postępowania:
H- podgrzewanie (ang. heating);
F- fluorescencja;
T- trypsyna;
B- wodorotlenek baru,

Trzecia litera oznacza zastosowany barwnik:

G-Giemsa,
Q-kwinakryna-fluoresceina,
A-oranż akrydynowy

C (prążki C) B (wodorotlenek baru) G (barwnik Giemsy)

3. Organizacja chromatyny somatycznej i plemnikowej

Jednym z ważniejszych procesów epigenetycznych występujących podczas spermiogenezy jest kompresja genomu plemnika uzyskana przez zastąpienie histonów protaminami.

Następuje wymiana somatycznych histonów przez tkankowo-specyficzne warianty, a następnie zastąpienie większości histonów (85% w ludzkim plemniku) przez białka przejściowe i następnie protaminy.

• W momencie zapłodnienia ojcowski genom dostarczony przez dojrzałe plemniki ma haploidalny genom i jest upakowany przez zwarte protaminy, zaś matczyny genom zatrzymany w II metafazie jest upakowany przez histony.

• Po zapłodnieniu, protaminy zostają szybko zastąpione przez histony i oocyt kończy drugą metafazę, uwalniając ciałko biegunowe.

• Histony H3 i H4, które związane są z ojcowską chromatyną, acetylują bardziej niż te obecne w matczynej chromatynie.

4. Heterochromatyna konstytutywna

Heterochromatyna konstytutywna nie jest tkankowo specyficzna.

Jest bogata w sekwencje powtarzalne tandemowo, charakteryzuje się metylacją lizyny 9 w histonie H3 i hypermetylacją DNA.

Metylacja H3K9 jest centralną modyfikacją znakującą funkcjonalnie odrębne obszary chromatyny.

Heterochromatyną konstytutywna zajmuje względnie stałe miejsce w chromosomie, najczęściej są to okolice centromeru i telomerów.

Jest zawsze skondensowana, nieaktywna genetycznie i replikuje się w późnej fazie S.

Genetyczna inaktywacja i formowanie heterochromatyny są kontrolowane przez specyficzny mechanizm genetyczny, który obejmuje metylację DNA i potranslacyjne modyfikacje histonów, dokonywane przez białka niehistonowe.
Stan wyciszenia aktywności genetycznej jest dziedziczony w kolejnych pokoleniach komórek.

Wszystkie obszary heterochromatynowe są objęte tym samym mechanizmem wyciszenia.
Heterochromatyna konstytutywna jest zbudowana z sekwencji wysoce powtarzalnych, bogatych w pary AT, zawierających motywy o długości od około 60 pz do kilkuset par zasad, co odróżniają od sekwencji euchromatynowych.
Umiejscowienie heterochromatyny konstytutywnej zarówno u organizmów roślinnych, jak i zwierzęcych jest cechą specyficzną gatunkowo.
Heterochromatyna odgrywa negatywną rolę w crossing-over. Proces ten nie zachodzi w miejscach występowania heterochromatyny konstytutywnej.
Bloki heterochromatynowe hamują formowanie chiazm, także w przyległych regionach euchromatynowych. Heterochromatyna wpływa nie tylko na zmniejszenie liczby chiazm, lecz także na ich rozmieszczenie.

Podstawowe funkcje heterochromatyny konstytutywnej

W organizacji domen jądrowych — heterochromatyna zwykle
jest zlokalizowana na peryferiach jądra komórkowego, w
połączeniu z otoczką jądrową, co pozwala na koncentrację
euchromatyny w centrum jądra, zapewniając maksymalną
wydajność replikacji i transkrypcji tej frakcji chromatyny;
W centromerze — heterochromatyna centromerowa jest
konieczna dla spójności chromatyd siostrzanych i poprawnej
segregacji chromosomów;
W represji genów — heterochromatyna odgrywa ważną rolę w
kontroli transkrypcji genów; jeśli geny zostaną umieszczone
blisko domen heterochromatynowych, mogą zostać wyciszone.

5. Choroby – mutacja dynamiczna

Choroby wywołane mutacjami dynamicznymi

• pląsawica Huntingtona – typ dziedziczenia autosomalny dominujący

Pląsawica Huntingtona lub choroba Huntingtona (łac. chorea chronica hereditaria progressiva, ang. Huntington’s disease, chorea progressiva maior, HD) – choroba genetyczna ośrodkowego układu nerwowego objawiająca się zaburzeniami ruchowymi, zaburzeniami psychicznymi oraz otępieniem. Pląsawica Huntingtona ma przebieg postępujący. Początek zazwyczaj objawia się między 30. a 50. rokiem życia. Choroba występuje rodzinnie i dziedziczona jest autosomalnie dominująco. Wśród osób pochodzenia europejskiego występuje z częstością od 4 do 15 na 100000.

• zespół łamliwego chromosomu X – typ dziedziczenia sprzężony z chromosomem X dominujący

• dystrofia miotoniczna – typ dziedziczenia autosomalny dominujący

• choroba Friedreicha (ataksja Friedreicha) – typ dziedziczenia autosomalny recesywny

• ataksja rdzeniowo-móżdżkowa – typ dziedziczenia autosomalny dominujący

• choroba Kennedy’ego – typ dziedziczenia sprzężony z chromosomem X recesywny

6. Nieprawidłowości kariotypu.

37,XX,der(13:17) –

Zespół Downa (ang.Down syndrome), trisomia 21, dawniej nazywany mongolizmem – zespół wad wrodzonych spowodowany obecnością dodatkowego materiału genetycznego chromosomu 21. Eponim pochodzi od nazwiska Johna Langdona Downa. Występowanie trisomii chromosomu 21 opisane zostało po raz pierwszy w 1959 r. przez francuskiego genetyka Jerome’a Lejeune’a^[1]^[2]

60,XY,ins(3)(q) –

47,XX,+13 –

Zespół Pataua (ang. Patau syndrome) – zespół wad wrodzonych spowodowany trisomią chromosomu 13 (kariotyp 47,XX,+13 albo 47,XY,+13).

Trisomia 13 spowodowana jest nierozejściem się chromosomów podczas I lub II podziału mejotycznego u któregoś z rodziców (opóźnione rozchodzenie się chromosomów w anafazie). W wyniku tej aberracji ilość DNA jest większa o 3,6% niż w prawidłowym kariotypie.